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第422章多分子克隆（第1页）

到了三级文明，有关克隆，已经研究到了分子水平，也就是分子克隆！

什么是分子克隆呢？

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定dna片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入dna的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

分子克隆是指分离一个已知dna序列，并以invivo（*内）方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取dna片段中的基因，但也可用来增加某些任意的dna序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的dna片断。

将dna片段（或基因）与载体dna分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为dna和cdna克隆两类。

cdna克隆是以mrna为原材料，经体外反转录合成互补的dna（cdna），再与载体dna分子连接引入寄主细胞。每一cdna反映一种mrna的结构，cdna克隆的分布也反映了mrna的分布。特点是:

有些生物，如rna病毒没有dna，只能用cdna克隆;

cdna克隆易筛选，因为cdna库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cdna克隆只含一个mrna的信息;

cdna能在细菌中表达。cdna仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。

那么，如何做到这一点呢？

首先是dna片段的制备！

常用以下方法获得dna片段:1用限制性核酸内切酶将高分子量dna切成一定大小的dna片段;2用物理方法（如超声波）取得dna随机片段;3在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下。用人工方法合成对应的基因片段;4从mrna反转录产生cdna。

其次是载体dna的选择，这里要知道，什么是质粒。

质粒是细菌染色体外遗传因子。dna呈环状，大小为1-200千碱基对（kb）。在细胞中以游离超螺旋状存在。很容易制备。质粒dna可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是‘紧密型‘;二是‘松弛型‘。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的dna片段，适用于构建原核生物基因文库，cdna库和次级克隆。

柯斯（cos）质粒是一类带有噬菌体dna粘性末端顺序的质粒dna分子。是噬菌体-质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源dna片段。也能象一般质粒一样携带小片段dna，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。

而噬菌体dna。常用的λ噬菌体的dna是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体dna两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cdna库。

m13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有f基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。m13dna（rf）在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主复制，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链dna的m13噬菌体。又能方便地制备单链dna，用于dna顺序分析、定点突变和核酸杂交。

接着是dna载体的连接。

dna分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有:1粘性末端连接。dna片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化dna可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。2平头末端连接，用物理方法制备的dna往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头dna片段可在某些dna连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高;3同聚寡核苷酸末端连接。4人工接头分子连接，在平头dna片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。

连接反应需注意载体dna与dna片段的比率。以λ或cos质粒为载体时。形成线性多连体dna分子，载体与dna片段的比率高些为佳。以质粒为载体时。形成环状分子，比率常为1∶1。

最后是引入寄主细胞。

常用两种方法:1转化或转染。方法是将重组质粒dna或噬菌体dna（m13）与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待dna被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组dna低，原因是连接效率不高，有许多dna分子无转化能力，而且重组后的dna分子比原载体dna分子大，转化困难。2转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

此时的李安，操控着墨莲人，不断的收集材料，进行着研究。

三级文明，分子克隆有很多的作用！

分子克隆技术是发展起来的不久，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域。打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

利用分子克隆技术已将胰岛素。人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。

通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性。例如sv40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。

通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如sv40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞。发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。

植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

一个有关于李安的躯体正在不断的形成......

“这是一个多顺反子，在这里，在这里！为了自己的身体变得完美！”

既然是建造自己的身体，李安尽量让自己变得完美。

在原核细胞中，通常是几种不同的mrna连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mrna叫做多顺反子mrna。顺反子的概念来自遗传学中的顺反重组试验，是确定交换片段究竟在一个基因内还是属于两个基因的试验，简言之。一个顺反子就是一个基因，多顺反子就是多个基因。真核生物中也有多顺反子，比如c.elegans共有个基因。约25%的是多顺反子。

mrna存在于原核和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。rna病毒和rna噬菌体中的rna既是遗传信息的载体又具有mrna的功能。生物体mrna种类的多少与生物进化水平有关，高等生物所含的遗传信息多，mrna的种类也多。生物体内某种mrna的含量根据需要而有不同，如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量丝心蛋白，因而编码丝心蛋白的mrna含量特别多。有些细菌需要不断多顺反子适应外部环境，其体内编码某些诱导酶的mrna的含量也较多。

原核和真核生物mrna有不同的特点:1原核生物mrna常以多顺反子（见）的形式存在，即一条mrna链编码几种功能相关联的蛋白质。真核生物mrna一般以单顺反子的形式存在，即一种mrna只编码一种蛋白质。2原核生物mrna的转录与翻译一般是偶联的，即转录尚未完毕。蛋白质的转译合成就已开始。真核生物转录的mrna前体则需经后加工，加工为成熟的mrna与蛋白质结合生成信息体后才开始。工作信息体中蛋白质与rna之比约为3。3原核生物mrna半寿期很短，一般为几分钟。最长只有数小时（rna噬菌体中的rna除外）。真核生物mrna的半寿期较长，如胚胎中的mrna可达数日。4原核与真核生物mrna的结构特点也不同。

一级结构与功能的关系:原核生物mrna一般5端有一段不翻译区，称前导顺序，3端有一段不翻译区，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。如大肠杆菌乳糖操纵子mrna编码3条多肽链;色氨酸操纵子mrna编码5条多肽链。也有单顺反子形式的细菌mrna，如大肠杆菌脂蛋白mrna。原核生物mrna分子中一般没有修饰核苷酸，也没有5端帽子结构和3端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mrna的起始密码子（aug）附近（5方向上游）的一小段长短不等的顺序，含有较多的嘌呤核苷酸，被称为sd顺序。（未完待续）

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